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杭州联科生物技术股份有限公司
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流式细胞术基本原理（二）
人阅读 发布时间：2020-08-26 02:20
常见流式细胞仪及结构
1.常见流式细胞仪
其中的BD Accuri C6是自动调节电压的。
2.流式细胞仪的结构
液流系统（fluidics）：液流系统将样本悬液聚焦在光源的中心处
当检测分辨率要求不是很高的实验，可以提高样本进样速度，从而提高采样分析速度；当检测分辨率要求高的实验应选择低的进样速度，如DNA分析。
光学系统（optics）：光学系统由激光器和若干组透镜、滤光片及小孔组成，它们分别将不同波长的荧光信号送入到不同的电子探测器。其主要光学元件是分色反射镜(DL)和滤光片(filter)。分色反射镜(488DL、550DL、600DL、640DL)用于选择被测荧光波长，只允许大于特定波长的光通过，而将小于特定波长的光反射到光电检测器。滤光片一般分为三类：长通滤片(long pass filter，LP)、短通滤片(short pass filter，SP)和带通滤片(band pass filter，BP)。
例如，FITC染料发射出525 nm的绿色荧光，PE染料发射出575 nm的橙色荧光，分别选择550DL和525BP组成的滤片组和600DL和575BP滤片组，即可达到特异地接收FITC和PE荧光信号的目的。光电倍增管和硅光电二极管，可分别将侧向散射光和前向散射光以及525～675等不同的荧光信号收集检测
检测分析系统（electronics）：将模拟信号转化为数字信号；计算每个脉冲峰的高度、宽度和面积；和计算机连接以传出数据。
检测信号的类型：散射光信号（FSC，SSC），荧光信号（自发荧光，特异荧光）。
前向散射光（FSC）的强度与细胞大小有关，对于同一个细胞群体，散射光强的细胞大一些，而散射光弱的细胞小一些。侧向散射光（SSC）对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，对胞质内较大的颗粒也有反应，可获得有关细胞内部精细结构和颗粒性质及膜表面光滑程度的有关信息。荧光信号有特征荧光和自发荧光两类。特征荧光是指用荧光染料对细胞进行特异性染色，受到光照射后发出的荧光。自发荧光是指未染色的细胞，受到光照射后所发出的荧光。其荧光强弱与细胞的大小、细胞的类型、激发光的波长和发射光的检测范围等有关，细胞中产生自发荧光的分子可能是核黄素和细胞色素等。在培养细胞中死细胞比活细胞的自发荧光要强。用流式细胞仪测定细胞的特征荧光时，自发荧光对所测定特征荧光是一种本底信号，应在设定阴性对照样品时加以去除，同时应尽可能地选用较亮的荧光染料染色细胞，提高信号/噪声比，以减少自发荧光的干扰，这是在样品处理与测量中应特别注意的问题。
荧光补偿：对于双标记或三标记荧光染色的样品，在应用FCM测量时需要对荧光信号的光谱重叠部分进行校正，当用一束激光激发两种荧光染料，而同时发出两种不同波长的荧光时，从理论上讲，可以通过选择滤片使检测器只检测其中一种荧光，但由于两种荧光的发射光谱不可避免的有重叠，在实际测量中当两波长比较接近，如FITC发射的525 nm荧光和PE发射的575 nm荧光会发生交叉干扰，使被测信号失真，测量结果产生较大的误差。因此须采用荧光补偿方法来解决这种交叉重叠的问题。目前生产厂家都提供有荧光补偿的实用程序，用厂商指定的488 nm激光激发的三种荧光染料(FITC、PE、PerCP)，在测量中加以正确补偿即可比较容易达到正确测量荧光信号的目的。
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