在流式细胞术实验,各种荧光素标记的抗体是必不可少的。那么荧光素该如何选择呢,通常会参考以下5个方面:
1. 流式细胞仪配置:仪器需满足激光管可激发相应的荧光素且可同时检测所需的荧光。附常见荧光素的激发波长和发射波长:
2. 染料的亮度与抗原表达量相匹配:低表达抗原,推荐使用亮荧光染料;高表达抗原,推荐使用弱荧光染料。
3. 荧光染料重叠最小化:尽量选择光谱重叠小的荧光素,如FITC/PE-Cy7;选择不同激光激发的荧光素,如FITC/APC,PE/APC。光谱重叠严重的荧光素同时检测会导致荧光溢漏,需调节补偿。
4. 避免复合染料联合使用带来的假阳性:常见的复合染料有PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PerCP-Cy5.5、APC-Cy7等,复合染料的信号衰退会降低APC或PE的灵敏度。如果出现信号衰退,则:
a. 减少样本暴露于光、高温或固定剂;
b. 选择染料时考虑:复合染料的信号衰退会降低APC或PE的灵敏度,避免染料和其衍生物在同一细胞上标记。选择更稳定的tandem-dye(PerCp-Cy5.5);
c. 如果样本需固定,选择稳定、可有效阻止复合染料信号衰退的固定剂Paraformaldehyde:冰上固定10min,离心除去Paraformaldehyde,将样品重悬于PBS中。