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流式细胞术—荧光素的选择

4279 人阅读发布时间:2020-09-22 11:49

在流式细胞术实验,各种荧光素标记的抗体是必不可少的。那么荧光素该如何选择呢,通常会参考以下5个方面:
1. 流式细胞仪配置:仪器需满足激光管可激发相应的荧光素且可同时检测所需的荧光。附常见荧光素的激发波长和发射波长:
2. 染料的亮度与抗原表达量相匹配:低表达抗原,推荐使用亮荧光染料;高表达抗原,推荐使用弱荧光染料。
 
流式细胞术—荧光素的选择

3. 荧光染料重叠最小化:尽量选择光谱重叠小的荧光素,如FITC/PE-Cy7;选择不同激光激发的荧光素,如FITC/APCPE/APC光谱重叠严重的荧光素同时检测会导致荧光溢漏,需调节补偿。
 

流式细胞术—荧光素的选择

4. 避免复合染料联合使用带来的假阳性:常见的复合染料有PE-Cy5PE-Cy5.5PE-Cy7PerCP-Cy5.5APC-Cy7等,复合染料的信号衰退会降低APCPE的灵敏度。如果出现信号衰退,则:
    a. 减少样本暴露于光、高温或固定剂;
    b. 选择染料时考虑:复合染料的信号衰退会降低APCPE的灵敏度,避免染料和其衍生物在同一细胞上标记。选择更稳定的tandem-dyePerCp-Cy5.5);
    c. 如果样本需固定,选择稳定、可有效阻止复合染料信号衰退的固定剂Paraformaldehyde:冰上固定10min,离心除去Paraformaldehyde,将样品重悬于PBS中。
 

5. 尽量使用红色激光激发自发荧光高的样本:每种细胞群都有不同水平的自发荧光。所有的荧光通道均可观察到自发荧光,但自发荧光强度在波长较长时迅速降低。对自发荧光较强的细胞,选择红光激发,发射波长长的荧光素(如APC)可得到较好的S/N比值;对自发荧光比较弱的细胞,发射波长长的荧光素对S/N提高没有明显的改善,可选用FITC

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