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流式细胞术—荧光染色
人阅读 发布时间:2020-09-22 11:44
细胞免疫表型分析是流式细胞术的一种重要应用,免疫表型分析实验常包括单细胞悬液制备、细胞表面抗体染色、胞内抗体染色和核内抗体染色等步骤。关于流式实验抗体染色的具体操作步骤如下。
(一)表面抗体染色
1. 细胞样本:
2. 全血样本:
(三)核内抗体染色
注意:如不能立即检测,用0.5 ml 0.1%~4%Paraformaldehyde重悬,4℃避光保存,24 h内上机分析。
相关文章如下:
流式细胞术基本原理(一)
流式细胞术基本原理(二)
流式细胞术基本原理(三)
流式细胞术—荧光知识
流式细胞术—荧光素的选择
流式细胞术—荧光染色
流式细胞术—样本制备
细胞凋亡检测方法
(一)表面抗体染色
1. 细胞样本:
a. 取100 μl细胞悬液(细胞计数后用流式染色缓冲液调整浓度为1×107/ml);
b. 加入适量表面抗体,室温避光孵育15 min(抗体用量和孵育条件详见抗体说明书);
c. 加入1~2 ml流式染色缓冲液,300 g离心5 min,弃上清;
d. 用 500 μl流式染色缓冲液重悬细胞,上机检测并分析。
2. 全血样本:
a. 取一定体积抗凝全血(人100 μl,小鼠取30~50 μl);
b. 加入适量表面抗体,室温避光孵育15 min(抗体用量和孵育条件详见抗体说明书);
c. 按溶血素(红细胞裂解液)使用说明裂解红细胞;
d. 加入1~2 ml流式染色缓冲液,300 g离心5 min,弃上清;
e. 用 500 μl流式染色缓冲液重悬细胞,上机检测并分析。
注意:如不能立即检测,用0.5 ml 0.1%~4%Paraformaldehyde重悬,4℃避光保存,24 h内上机分析。
注意:如不能立即检测,用0.5 ml 0.1%~4%Paraformaldehyde重悬,4℃避光保存,24 h内上机分析。
(二)胞内抗体染色
a. 制备好细胞悬液,取100 μl(全血样本:人100 μl,小鼠30~50 μl)染表面抗体,室温避光孵育15 min,不用洗涤;
b. 加入100 μl FIX&PERM MEDIUM A固定剂,室温孵育15 min;
c. 加入3 ml流式染色缓冲液,300 g离心5 min,弃上清,涡旋振荡,使残留液体混匀沉淀;
d. 加入100 μl FIX&PERM MEDIUM B破膜剂和胞内抗体(和/或相应的同型对照),室温避光孵育15 min;
e. 加入3 ml流式染色缓冲液,300 g离心5 min,弃上清收集细胞;
f. 用500 μl 流式染色缓冲液重悬细胞,上机检测并分析。
注意:如不能立即检测,用0.5 ml 0.1%~4%Paraformaldehyde重悬,4℃避光保存,24 h内上机分析。
(三)核内抗体染色
a. 使用FoxP3/Transcription Factor Staining Buffer Kit,也适用于胞浆和核内蛋白的同时检测
b. 取100 μl样本,根据实验方案和产品说明书,加入适量抗体进行表面染色;全血样本孵育抗体后加入不含固定剂的溶血素(按厂家说明操作),溶血完毕;
c. 加入2 ml流式染色缓冲液,300 g离心5 min,弃去上清;
d. 配置1×固定/破膜工作液,注意要新鲜配制;
e. 每管加入1 ml固定/破膜工作液,涡旋振荡混匀,室温避光孵育30-60 min;
f. 用蒸馏水稀释配置1×破膜缓冲液;在流式管中染色,每个样本需要 8.5 ml;
g. 无需洗涤,每管加入2 ml 1×破膜缓冲液,300 g 离心5 min,弃去上清;
h. 重复步骤6(可选);
i. 用100 μl 1×破膜缓冲液重悬细胞;
j. 加入2 μl胞内抗体来源的血清阻断,室温避光孵育15 min;
k.无需洗涤,体系加入适量的FoxP3抗体或其他核内及胞浆抗体或等量的同型对照(抗体用量和孵育条件详见抗体说明书),振荡混匀,室温避光孵育至少30 min;
l.每管加入2 ml 1×破膜缓冲液,300 g离心5 min,弃去上清;
m. 重复步骤11(可选);
n.用500 μl流式染色缓冲液重悬细胞,上机检测并分析。
注意:如不能立即检测,用0.5 ml 0.1%~4%Paraformaldehyde重悬,4℃避光保存,24 h内上机分析。
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