小白:	师兄，为什么我样本中测到的Th细胞这么少，基本没有？

 

师姐:	你这是不是没加刺激阻断剂啊？

应用流式细胞术检测Th细胞的小伙伴要注意啦，刺激阻断剂是实验成功必不可少的要素，千万别忘记咯。那为什么要用刺激阻断剂呢？

静息状态 (即未受任何刺激，如人的正常生理状态)下，Th细胞分泌IFN-γ、IL-4 和 IL-17A 等细胞因子的含量极少，无法被检测到。而当 Th 细胞受到刺激剂刺激，细胞因子表达量会有显著提高。实验中检测的Th细胞实际上是检测Th细胞对刺激素刺激的反应能力。同时，细胞内合成的细胞因子可通过高尔基体运输以可溶性形式分泌至细胞外，而流式细胞仪无法检测细胞外的抗原，所以需要用阻断剂破坏高尔基体以切断细胞因子的转运途径，阻断其分泌。通常选用的刺激素为 Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA, 佛波酯)和 Ionomycin (离子霉素)，阻断剂为Brefeldin A (BFA, 布雷非德菌素 A)和/或 Monensin (莫能霉素)。
 

 

  各 种 样 本 刺 激 活 化 

肝素抗凝血：

取 125 μl 抗凝血至流式管中，加入 125 μl不含血清的培养基和1 μl PMA/Ionomycin Mixture (250×)和1 μl BFA/Monensin Mixture (250×)。混匀，37℃孵育 4 - 6 小时，每隔 1 - 2 小时取出震荡混匀。

其它抗凝剂(如EDTA、枸橼酸钠)抗凝血：

用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞 (PBMCs)。用含 10 %胎牛血清的培养基重悬沉淀，使细胞浓度为1 × 107/ml。取 250 μl PBMCs 至流式管中，加入 1 μl PMA/Ionomycin Mixture (250×)和1 μl BFA/Monensin Mixture (250×)。混匀，37℃孵育 4 - 6小时，每隔 1 - 2 小时取出震荡混匀。

脾脏组织：

使用适当的方法制备成单细胞悬液，并去除团块。(可选)使用淋巴细胞分离液分离制备脾单个核细胞。用含 10 %胎牛血清的培养基重悬沉淀，使细胞浓度为 1 × 107/ml。取 250 μl 细胞悬液至流式管中，加入 1 μl PMA/Ionomycin Mixture (250×)和 1 μl BFA/Monensin Mixture (250×)。混匀，37℃孵育 4 - 6 小时，每隔 1 - 2 小时取出震荡混匀。
 

相关试剂：
 

目录号	产品名称	规格型号
70-CS1001	PMA/Ionomycin mixture(250X)佛波酯/离子霉素混合物	100/500 μl
70-CS0001	Phorbol 12-myristate 13-Acetate （PMA）	100/500 μl
70-CS0002	Ionomycin Calcium（离子霉素）	50/500 μl
70-CS1002	BFA/Monensin Mixture(250X)布雷非德菌素A/莫能霉素混合物	100/500 μl
70-CS0003	Brefeldin A（BFA）布雷非德菌素A	60 μl
70-CS0004	Monensin Sodium（莫能霉素）	100 μl