Fluo-3AM 的原理：

FLUO-3 广泛用于长波长的荧光钙指示剂。其在 506NM 处被吸收，可以被氩离子激光的 488nm 激发光激发，便于检测。FLUO-3 在没有同钙结合的情况下，无荧光产生。但是，在与钙结合后，荧光（526nm）增强至少 40 倍。Fluo-3 AM 是一种可以穿透细胞膜的荧光染料。Fluo-3 AM 的荧光非常弱，其荧光不会随钙离子浓度升高而增强。Fluo-3 AM 进入细胞后可以被细胞内的酯酶剪切形成 Fluo-3，从而被滞留在细胞内。Fluo-3 可以和钙离子结合，结合钙离子后可以产生较强的荧光，最大激发波长为 506 nm，最大发射波长为 526 nm。实际检测时推荐使用的激发波长为 488 nm 左右，发射波长为 525-530 nm。

流式操作的推荐步骤：

1、收集细胞，重悬到 106 个细胞。
2、（可选步骤）加入丙磺舒，使终浓度达到 1-2.5 mM 或苯磺唑酮，终浓度为 0.1–0.25 mM。（丙磺舒可提高细胞染色效率，减少 Fluo-3 AM 外漏）。
3、加入 Fluo-3 AM，使终浓度为 0.5-5 μM（具体浓度需要自己优化），20-37℃ 孵育 15-60 分钟。
4、用细胞染色缓冲液洗涤细胞三次，加入 500 ul 染色缓冲液，37℃ 条件下孵育 20-30 min，确保 Fluo-3 AM 在细胞内完全转变成 Fluo-3。但需注意此时如放 37℃ 时间较长会增加 fluo3 从细胞的流失。
5、Fluo-3 AM 的激发波长为 488 nm，发射波长为 525 nm。

正对照的设置：

关于正对照，经典使用 ionomycin 刺激淋巴细胞作为正对照，刺激浓度为 1-2ug／ml。

具体做法是：

采集数据时用双指数直方图，x 轴为时间，y 轴为 Fluo3（线性）。
首先收集样品大约 1 分钟，此时可以调节 FL1 电压使 Fluo3 基线信号在 50 左右或者以下。
然后软件上不中止样品的收集，但是迅速把样品管取出，往管中加 入 ionomycin，混匀，然后放入采集处继续采集数据大约 5 分钟。此时应看到信号很快大幅度上升。

注意，为了去除流式仪器中残存的 ionomycin 或其他刺激物（以免引起下一个样品的误差），样品间最好用漂白水洗一下机子。

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