2. 用去离子水（不能用 PBS）将溶血素稀释成 1×。每管用量为 2ml。

3. 染色完的全血不用洗，加 2ml 稀释好的溶血素，迅速混匀，静置 8~10 分钟，观察溶液透亮后用预冷 PBS 溶液洗涤细胞，300 -400 g 离心 5 分钟，去上清。

4. 用 3 倍体积的固定/破膜稀释液（#ICD01） 稀释 固定/破膜浓缩液（#ICC01），制成固定/破膜工作液，注意要新鲜配制，每管的用量为 1ml。

5. 旋涡震荡重悬细胞后加入 1ml 的固定/破膜工作液（Fixation/Permeabilization）（1:3 稀释好），并再次旋涡混匀。

6. 避光 4℃孵育 30 分钟到 60 分钟。

7. 将破膜缓冲液（#ICB01）用去离子水 1:9 稀释，制成工作液。每管的用量为 8.5ml。

8. 无需洗涤，直接加入 2ml 破膜缓冲液工作液（Permeabilization Buffer）300 -400 g 离心洗涤细胞并弃去上清液。

9.（可选）重复第 9 步操作洗涤细胞。

10. 加入 100 ul PBS 重悬细胞。

11. 加入大鼠血清 2 ul，室温避光孵育 30 分钟。

12. 加入适量的 Foxp3 抗体，对照管中加入适量的同型对照，具体用量参照说明书，避光 4℃孵育至少 30 分钟。

13. 加入 2ml 破膜工作液离心洗涤细胞并弃去上清液。

14. 重复上一步洗涤细胞。

15. 用适量体积的 Flow Cytometry Staining Buffer 重悬细胞，并上机检测并分析。注：由于染色过程中使用了细胞固定和破膜，对比起活细胞在形态上会有一定变化，因此FSC/SSC 图中圈门时需要做一定调整。

注：以上说明书仅供参考，具体实验请对照厂商说明书操作。