ELISA通关必备丨试剂盒构成及检测原理

 

• ELISA简要操作步骤及原理
• ELISA 试剂盒组分
  • 酶标板（Microplate）
  • 标准品（Standard）
  • 生物素标记的检测抗体(Detected Antibody)
  • 洗涤液(Washing Buffer)
  • 辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(HRP-Streptavidin)
  • 显色底物 (TMB)

ELISA简要操作步骤及原理

以双抗体夹心法为例，ELISA简要操作步骤如下：

1. 包被抗体包被到酶标板
2. 加样本/标准品
3. 加生物素标记的检测抗体
4. 加HRP标记的链霉亲和素
5. 加显色底物TMB
6. 加终止液

ELISA 试剂盒组分

酶标板（Microplate）

酶标板，在ELISA（酶联免疫吸附测定）中作为载体的酶标板对抗原抗体或抗原抗体复合物的吸附起着重要作用。

标准品（Standard）

标准品即为已知浓度的目标物(样本中待测因子)的纯蛋白，对标准品进行梯度稀释，用于制作标准曲线。

生物素标记的检测抗体(Detected Antibody)

检测抗体即为与目标物特异性结合的抗原/抗体鉴于酶标二抗的局限性，现在厂家一般引入生物素亲和素系统(biotin avidin system,BAS)。

洗涤液(Washing Buffer)

长时间的孵育后，会出现非特异性结合，这时就需要洗涤液来洗去非特异性结合的蛋白或抗体。常用的洗涤液有:磷酸盐缓冲液(PBS)、平衡盐缓冲液(BBS)等。

辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(HRP-Streptavidin)

链霉亲和素是Streptomyces avidinii(阿维丁链霉菌)的分泌物。链霉亲和素分子由4条相同的肤链组成，非特异性结合远比亲和素低。在ELISA试剂盒中，用于与检测抗体上的生物素相结合。

显色底物 (TMB)

TMB在过氧化氢存在的情况下可被HRP或其他过氧化物酶催化生成可溶的蓝色物一价物。当显色反应被酸性溶液终止后，产物由蓝色一价物转为黄色二价物，此时可在450nm 测定吸光度。