ELISA实验加入显色底物后，标准品有颜色，但结果分析发现标准品最高点吸光值偏低或偏高、标准曲线无梯度等等，总结如下原因：

 

一、 标准曲线最高点吸光值偏高，超出仪器检测范围

ELISA标准曲线最高点的吸光值一般在3.0以下，若太高超出仪器检测范围，显示OVER FLOW，可能原因：
 

序号	可能原因	解决方法
1	如OD绝对值靠谱，则显色过度	TMB显色体系中建议根据S1，S2颜色进行判断， 当S1，S2深蓝色，有明显梯度，S5有淡蓝色时即可终止。
2	仅作单波长检测	由于参考波长读取非特异性检测，如指纹、划痕、水渍等， 对结果也有影响。建议最终结果以双波长为最准确。

 

二、 标准曲线最高点吸光值偏低

ELISA标准曲线最高点的吸光值一般要在0.8以上，若小于0.8，可能的原因：
 

序号	可能原因	解决方法
1	粉末标准品未充分溶解	粉末标准品按说明书加一定体积的液体后，轻柔混匀， 室温静置30分钟，充分溶解。
2	标准品反复冻融	标准品反复冻融后活性降低。
3	孵育温度、时间	按说明书要求孵育条件进行孵育。
4	显色时间控制	TMB显色体系中建议根据S1，S2颜色进行判断，当S1，S2深蓝色，有明显梯度，S5有淡蓝色时即可终止。

 

三、标准曲线无梯度

ELISA 实验中标准品2倍倍比稀释，但结果分析标准曲线没有梯度，可能的原因：
 

序号	可能原因	解决方法
1	样品或标准品污染	避免污染
2	错误的样品或标准品的稀释	完全按照说明书稀释
3	偶联抗体浓度过高	按照说明书调整到最佳的浓度
4	TMB底物孵育时间过长	调整到合适的孵育时间
5	错误的孵育时间或温度	完全按照说明书
6	孵育时未加盖导致溶液挥发和污染	贴封片或加盖

 

总结

得到完美ELISA标准曲线，需要注意几点：

1、 充分溶解标准品；

2、 标准品避免反复冻融；

3、 梯度稀释标准品注意混匀。