月亮当空照

电话进来 niao

室友说喂喂喂

你为什么还没回来呢

我在实验室

天天不睡觉

做实验 做实验

胞内抗原还是测不到

我太难了

流式细胞术（FCM）常用于测定细胞表面/胞内/核内抗原对细胞进行免疫表型分析，在胞内/核内抗原检测时，可能会碰到“有与没有都一样”的尴尬情况，明明胞内有这个抗原但硬是检测不到。此时，当排除了实验误操作、抗体非特异性、标记淬灭等情况，不妨回头看看是否破膜问题吧。

 

为 何 要 用 破 膜 剂 ？

正常情况下，荧光标记的抗体无法通过完整的细胞膜进入细胞内，用流式细胞仪测定细胞内抗原，需先利用破膜剂破坏细胞膜的完整性，产生可供抗体通过的小孔。破膜效果的好坏将直接影响荧光染色和结果分析。

 

破 膜 剂 选 择 原 则

① 尽量保持细胞形态，使可根据散射光信号分析细胞种类，如区分淋巴细胞、单核细胞和粒细胞；

② 不影响细胞膜表面抗原与抗体的特异性结合（若需同时检测细胞内外抗原）。

 

常 见 破 膜 剂

① 皂素；

② 有机溶剂：乙醇、甲醇、丙酮等；

③ Triton-X、Tween-20。

 

优 劣 势 对 比

① 细胞形态影响：利用皂素破膜，外周血细胞的流式散射光图中淋巴细胞、单核细胞和粒细胞分群清晰；而另两种破膜剂，通过与细胞膜上的蛋白质和脂质作用发挥破膜效果，易导致细胞发生皱缩，这3群细胞很难分开；

② 对抗原影响：a.标记表面抗原和破膜两步操作的先后顺序有所影响：以检测表面 CD8 为例，先标记再破膜对 CD8 无明显影响，而先破膜再标记，乙醇和 Triton-X 会使表达 CD8 细胞比例和每个细胞上抗原表达量急剧下降；b.对不同抗原的影响不同：如检测 IFN-γ 时，Triton-X 破膜会导致其检测率降低，而皂素和乙醇无影响；检测 TNF-α 时，皂素的敏感性要高于其他两种。

③ 其他：皂素的破膜效果是可逆的，一旦被洗掉容易导致破膜失效，因此在后续实验过程中需用含有皂素的洗涤液洗涤；有机溶剂可实现固定和破膜；Triton-X 和 Tween-20 相似，可破坏所有脂质层，可破核膜。总体来说，皂素是相对理想的细胞破膜剂，但无法破核膜，若需破核膜还是要用 Triton-X 和 Tween-20。

胞内抗原检测一定会用破膜剂？

不一定。有些细胞内抗原会带有自发荧光，通过流式细胞仪即可对其进行检测和分析；若检测需要荧光素偶联的抗体特异性结合细胞内抗原，此时需要用到破膜剂。

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 联 科 生 物 破 膜 剂 

联科生物可提供 Fix & Perm Kit 固定破膜剂，包含 A 液和 B 液两种组分，可将细胞固定、减少对表面抗原的影响，并增加细胞膜的通透性，使荧光素标记的抗体可通过细胞膜与抗原结合。同时 B 液还可高效裂解红细胞，无需另外处理，减少对细胞的影响。【A 液固定，B 液破膜】

 

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目录号	产品名称	规格	目录价	限时特价
70-GAS003/2	Fix & Perm Kit固定破膜剂	50 T	560	200
70-GAS005/2	Fix & Perm Kit固定破膜剂	100 T	1060	400
70-GAS006/2	Fix & Perm Kit固定破膜剂	200 T	1960	700

 

破膜剂应用—胞内抗体染色

1. 制备好细胞悬液，取 100 μl（全血样本：人 100 μl，小鼠 30~50 μl）染表面抗体，室温避光孵育 15 min，不用洗涤；

2. 加入 100 μl FIX&PERM MEDIUM A 固定剂，室温孵育 15 min；

3. 加入 3 ml 流式染色缓冲液，300 g 离心 5 min，弃上清，涡旋振荡，使残留液体混匀沉淀；

4. 加入 100 μl FIX&PERM MEDIUM B 破膜剂和胞内抗体（和 / 或相应的同型对照），室温避光孵育 15 min；

5. 加入 3 ml 流式染色缓冲液，300 g 离心 5 min，弃上清收集细胞；

6. 用 500 μl 流式染色缓冲液重悬细胞，上机检测并分析。如不能立即检测，用 0.5 ml 0.1%~4% 多 - 聚 - 甲 - 醛重悬，4℃避光保存，24 h 内上机分析；