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当被《上学歌》洗脑,忽然想聊聊破膜剂

人阅读 发布时间:2020-11-12 17:08




月亮当空照

电话进来 niao

室友说喂喂喂

你为什么还没回来呢

我在实验室

天天不睡觉

做实验 做实验

胞内抗原还是测不到

我太难了


流式细胞术(FCM)常用于测定细胞表面/胞内/核内抗原对细胞进行免疫表型分析,在胞内/核内抗原检测时,可能会碰到“有与没有都一样”的尴尬情况,明明胞内有这个抗原但硬是检测不到。此时,当排除了实验误操作、抗体非特异性、标记淬灭等情况,不妨回头看看是否破膜问题吧。

 

为 何 要 用 破 膜 剂 ?

正常情况下,荧光标记的抗体无法通过完整的细胞膜进入细胞内,用流式细胞仪测定细胞内抗原,需先利用破膜剂破坏细胞膜的完整性,产生可供抗体通过的小孔。破膜效果的好坏将直接影响荧光染色和结果分析。

 

破 膜 剂 选 择 原 则

① 尽量保持细胞形态,使可根据散射光信号分析细胞种类,如区分淋巴细胞、单核细胞和粒细胞;

② 不影响细胞膜表面抗原与抗体的特异性结合(若需同时检测细胞内外抗原)。

 

常 见 破 膜 剂

① 皂素;

② 有机溶剂:乙醇、甲醇、丙酮等;

③ Triton-X、Tween-20。

 

优 劣 势 对 比

① 细胞形态影响:利用皂素破膜,外周血细胞的流式散射光图中淋巴细胞、单核细胞和粒细胞分群清晰;而另两种破膜剂,通过与细胞膜上的蛋白质和脂质作用发挥破膜效果,易导致细胞发生皱缩,这3群细胞很难分开;


② 对抗原影响:a.标记表面抗原和破膜两步操作的先后顺序有所影响:以检测表面 CD8 为例,先标记再破膜对 CD8 无明显影响,而先破膜再标记,乙醇和 Triton-X 会使表达 CD8 细胞比例和每个细胞上抗原表达量急剧下降;b.对不同抗原的影响不同:如检测 IFN-γ 时,Triton-X 破膜会导致其检测率降低,而皂素和乙醇无影响;检测 TNF-α 时,皂素的敏感性要高于其他两种。


③ 其他:皂素的破膜效果是可逆的,一旦被洗掉容易导致破膜失效,因此在后续实验过程中需用含有皂素的洗涤液洗涤;有机溶剂可实现固定和破膜;Triton-X 和 Tween-20 相似,可破坏所有脂质层,可破核膜。总体来说,皂素是相对理想的细胞破膜剂,但无法破核膜,若需破核膜还是要用 Triton-X 和 Tween-20。

胞内抗原检测一定会用破膜剂?
 

不一定。有些细胞内抗原会带有自发荧光,通过流式细胞仪即可对其进行检测和分析;若检测需要荧光素偶联的抗体特异性结合细胞内抗原,此时需要用到破膜剂。
 

[   联 科 生 物 破 膜 剂  ]

联科生物可提供 Fix & Perm Kit 固定破膜剂,包含 A 液和 B 液两种组分,可将细胞固定、减少对表面抗原的影响,并增加细胞膜的通透性,使荧光素标记的抗体可通过细胞膜与抗原结合。同时 B 液还可高效裂解红细胞,无需另外处理,减少对细胞的影响。【A 液固定,B 液破膜】


截至 12 月 31 日,凡购买联科生物固定破膜剂促销产品,即可享受目录价买 1 送 1 特惠。


破膜剂应用胞内抗体染色
 

1. 制备好细胞悬液,取 100 μl(全血样本:人 100 μl,小鼠 30~50 μl)染表面抗体,室温避光孵育 15 min,不用洗涤;

2. 加入 100 μl FIX&PERM MEDIUM A 固定剂,室温孵育 15 min;

3. 加入 3 ml 流式染色缓冲液,300 g 离心 5 min,弃上清,涡旋振荡,使残留液体混匀沉淀;

4. 加入 100 μl FIX&PERM MEDIUM B 破膜剂和胞内抗体(和 / 或相应的同型对照),室温避光孵育 15 min;

5. 加入 3 ml 流式染色缓冲液,300 g 离心 5 min,弃上清收集细胞;

6. 用 500 μl 流式染色缓冲液重悬细胞,上机检测并分析。如不能立即检测,用 0.5 ml 0.1%~4% 多 - 聚 - 甲 - 醛重悬,4℃避光保存,24 h 内上机分析;

 

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