通常所说的 Th17 是指在各种生理与病理条件下有能力分化为 Th17 的辅助性 T 细胞 (严格意义上是 Th0)。当受到外界因素 (如刺激素、病原体等) 刺激，Th0 即会向 Th1、Th2、Th17 等 Th 细胞分化，此时，通过检测分泌的细胞因子（如 IFN-γ、IL-4、IL-17 等）实现对各类 Th 细胞的检测。

Th17：主要分泌 IL-17、IL-22 等促炎因子，介导自身免疫性疾病和炎症反应。

考虑到静息状态下 Th0 分化为 Th1、Th2、Th17 等的能力非常弱及流式细胞仪无法检测分泌到细胞外的细胞因子等因素，检测 Th 细胞时需要添加刺激剂及阻断剂。
 

我们通常选用的刺激剂为 PMA (佛波酯)+ Ionomycin (离子霉素)，也有人选用 CD3/CD28 协同刺激、PHA 刺激等来活化 T 细胞。实验表明，PMA 为广谱性刺激，即 T 细胞中的各亚群均会被 PMA 同等激活，而 CD3/CD28 协同刺激和 PHA 刺激，则是通过 TCR 受体的作用，仅对部分 T 细胞亚群有效。所以可根据实验的需要来选择刺激方式。通常选用的阻断剂为 Brefeldin A (BFA, 布雷非德菌素 A) 和 / 或 Monensin (莫能霉素)，通过破坏高尔基体来切断细胞因子的转运途径，干扰其分泌。

另外，实验过程中涉及到如何正确的选定 Th（即 T 辅助细胞）的问题。Th 细胞的表面标志为 CD3+CD4+，而当用 PMA 刺激 4 小时时，会发现 CD4 + 的细胞明显减少，甚至消失，这是因为 PMA 会诱发细胞表面 CD4 分子被内吞。所以通常的做法是用 CD3 和 CD8 反设 CD4 细胞，即 CD3+CD8 - 的细胞被认为是 CD3+CD4 + 的细胞。（注：PMA 对小鼠 CD4 的影响很小，所以检测小鼠 Th17 时可用 CD4 直接设门）。

 

 Th17 检 测 步 骤 如 下 

 

 

一、 样本制备

・  全血标本

用肝素抗凝管采集静脉血（必须用肝素钠抗凝，不可用肝素锂、EDTA 或枸橼酸钠）1-2 ml，血液室温或 4℃放置，8 小时内必须进行检测，否则需弃用。

・  外周血单个核细胞（PBMC）标本

1. 对于使用其它抗凝剂（如 EDTA 或枸橼酸钠）抗凝血，采集静脉血至少 1 ml，采集后 4 小时内使用；

2. 加入等体积的 Hank’s 液或不含 Ca2 + 和 Mg2 + 的 PBS 或生理盐水稀释血液；

3. 取 1 ml 淋巴细胞分离液加入离心管中；

4. 将稀释血液小心地加到淋巴细胞分层液上，注意保持两者界面清晰；

5. 室温下，1500 r/min，离心 15 分钟；

6. 用毛细吸管轻轻吸出单个核细胞层，加入含有 4-5 ml Hank’s 液或不含 Ca2 + 和 Mg2 + 的 PBS 或生理盐水的试管中，充分混匀；

7. 1500 r/min，离心 10 分钟，弃上清后，再洗一次；

8. 弃上清，用含 10% 胎牛血清的培养基重悬单个核细胞，用台酚兰染色计数活细胞数（应在 95％以上）；

9. 调节细胞浓度为 1x107 细胞 /ml。

 

二、刺激效果检测（选做）

1. 全血标本：取 125 μl 抗凝血至流式管中，加入 125 μl 不含血清的培养基稀释到 250 μl；PBMC 标本：用含 10% 胎牛血清的培养基重悬单个核细胞，用台酚兰染色计数活细胞数 (应在 95％以上)；调节细胞浓度为 1×107/ml，取 250 μl；

2. 在标本中加入 1 μl 250×PMA/Ionomycin，混匀；

3. 37℃，5% CO2 培养箱培养 4～6 小时，期间注意相隔 1~2 小时混匀一次；

4. 取 100 μl 样本，加入 Human CD3（或 Mouse CD4）和 CD69 PE（用量详见说明书），室温孵育 20 分钟（全血样本溶血）后，用流式染色缓冲液洗一遍，300 g 离心 5 分钟，弃上清，用流式染色缓冲液重悬至 500 μl，上机检测；

5. CD3+（或 CD4+）细胞中，CD69 的阳性率应达到 90% 以上，进行下一步正式实验。

 

三、正式实验

1a. 全血标本：取 125 μl 抗凝血至流式管中，加入 125 μl 不含血清的培养基和 1 μl PMA/Ionomycin Mixture（250×）和 1 μl BFA/Monensin Mixture（250×）。取 125 μl 抗凝血和 125 μl 不含血清的培养基，作为对照。混匀，37℃孵育 4-6 小时，每隔 1-2 小时取出震荡混匀；

1b. PBMC 标本：用含 10% 胎牛血清的培养基重悬单个核细胞，使细胞浓度为 1×107/ml。取 250 μl PBMCs 至流式管中，加入 1 μl PMA/Ionomycin Mixture (250×) 和 1 μl BFA/Monensin Mixture (250×)。以只含 PBMCs 的样本作为对照。混匀，37℃孵育 4-6 小时，每隔 1-2 小时取出震荡混匀；

注：PMA/Ionomycin Mixture (250×) 和 BFA/Monensin Mixture (250×) 极易挥发，使用后请及时旋紧管盖。

2. 从样本管和对照管中取 100 μl 细胞悬液至新的流式管中，加入 5 μl Anti-Human CD3, FITC 和 5 μl Anti-Human CD8α, PerCP-Cy5.5（或加入 5μl Anti-Mouse CD3ε, FITC 和 5 μl Anti-Mouse CD4, PerCP-Cy5.5）。震荡混匀，室温避光孵育 15 分钟；

3. 每管加入 100 μl FIX & PERM Medium A，震荡混匀，室温避光孵育 15 分钟；

4. 用蒸馏水将 10×Flow Cytometry Staining Buffer 稀释为 1×，每管加入 2 ml 预冷 1×Flow Cytometry Staining Buffer，300 g 离心 5 分钟，弃上清；

注：液体尽量倒干净，不要有残留。

5. 每管加入 100 μl FIX & PERM Medium B 和 5 μl Anti-Human IL-17A, PE（或 5 μl Anti-Mouse IL-17A, PE）。震荡混匀，室温避光孵育 15 分钟；

6. 每管加入 2 ml 1×Flow Cytometry Staining Buffer，300 g 离心 5 分钟，弃上清；

7. 每管加入 500 μl 1×Flow Cytometry Staining Buffer 重悬，上机检测；或者加入 500 μl 1-4 % 多 * 聚 * 甲 * 醛重悬，2-8℃避光，于 24 小时内检测。

四、相关产品

 

目录号	产品名称	规格型号
70-KTH217	Mouse Th17 staining kit 小鼠辅助性 Th17 细胞检测试剂盒	25T/100T
70-KTH117	Human Th17 staining kit 人 Th17 染色试剂盒	25T/100T
70-KTH001	Human Th1/Th2/Th17 staining kit 人 Th1/Th2/Th17 染色试剂盒	25T/100T

结果示例

使用 Mouse Th17 Staining Kit 进行流式检测。正常 ICR 小鼠的静息肝素抗凝血 (A0)、EDTA 抗凝血来源的 PBMCs (B0)、脾细胞 (C0) 和脾单个核细胞 (D0) 染色 IL-17A。正常 ICR 小鼠的 PMA/Ionomycin 刺激的肝素抗凝血 (A1)、EDTA 抗凝血来源的 PBMC (B1) 脾细胞 (C1) 和脾单个核细胞 (D1) 染色 IL-17A。对 CD3+/CD4 + 细胞进行设门分析。

附赠 Th1/Th2 检测操作演示视频 ↓↓↓