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本期给大家带来的是细胞凋亡与细胞周期检测步骤详解：

 

[  细胞凋亡检测步骤—Annexin V法 ]

一、仪器参数调节

1. 收集1×106-3×106个细胞，用预冷 PBS 离心洗涤两次，弃上清。

2. 加入500 μl Apoptosis Positive Control Solution重悬，置冰上孵育30分钟。

3. 用预冷PBS离心洗涤，弃上清。

4. 加入适量预冷1×Binding Buffer重悬，并加入数量相同且未经处理的活细胞与之混合。加入预冷1×Binding Buffer 补充至1.5 ml，等分成三管，其中一管为空白对照管、两管为单染管。

5. 单染管分别加入5 μl Annexin V-FITC或10 μl PI，室温避光孵育5分钟。

6. 在流式细胞仪上，用空白管调节FSC、SSC和荧光通道的电压，并在此电压条件下，用单染管调节荧光通道的补偿。

注：某些将贴壁细胞处理为单个细胞的过程中会造成细胞膜损伤，从而造成Annexin V假阳性。因此需要进行优化。可使用对细胞更温和的酶如Accutase处理贴壁细胞。

二、样本检测

1. 按实验方案诱导凋亡。

2. 用预冷PBS离心洗涤，收集1-10×105个细胞(包括培养上清中的细胞)。用双蒸水稀释5×Binding Buffer为1×工作液，取500 μl 1×Binding Buffer重悬细胞。

3. 每管加入5 μl Annexin V-FITC和10 μl PI。

4. 轻柔涡旋混匀后，室温避光孵育5分钟。

5. 上机检测分析。在流式细胞仪上，通过FITC检测通道检测 Annexin V-FITC (Ex = 488nm; Em = 530 nm)和通过PI检测通道(Ex = 535 nm; Em = 615 nm)检测 PI。

 

[  细胞周期检测步骤  ]

一、可当天检测的活细胞样本

1. 收集2×105-1×106个细胞，离心弃上清。用PBS洗涤一次，离心弃上清。

2. 加入1 ml DNA Staining solution和10 μl Permeabilization solution，涡旋振荡5-10秒混匀。室温避光孵育30分钟。

3. 选择最低上样速度，在流式细胞仪上进行检测。如需在荧光显微镜下观察，则离心细胞，弃上清，加入新鲜缓冲液重悬。滴加1滴细胞悬液至载玻片，盖上盖玻片后使用合适的滤光片进行观察。

二、当天无法检测的活细胞样本

1. 按照下述方法固定，或其他合适的方法固定

a. 收集2×105-1×106个细胞，离心弃上清。轻弹管壁，使沉淀重悬在残余的液体中，加入1 ml室温下的PBS。

b. 将细胞缓慢加入至3 ml无水乙醇(-20℃预冷)中，边加边高速搅拌。-20℃固定过夜，可保存数月。

2. 检测当天，将固定细胞离心，弃去乙醇，轻弹管壁使沉淀松散，加入2-5 ml室温下的PBS，放置15分钟使细胞再次水化。离心，弃上清。

3. 加入1 ml DNA staining solution，涡旋振荡5-10秒混匀。室温避光孵育30分钟。

4. 选择最低上样速度，在流式细胞仪上进行检测。如需在荧光显微镜下观察，则离心细胞，弃上清，加入新鲜缓冲液重悬。滴加1滴细胞悬液至载玻片，盖上盖玻片后使用合适的滤光片进行观察。