成熟T细胞通过TCR识别并与抗原-MHC复合物反应。TCR活化的最直接后果是信号通路的起始，这些信号通路包括诱导特异性蛋白酪氨酸激酶（PTKs）、PIP2分解、PKC活化以及细胞内钙离子浓度的升高。这些早期事件被传递到核，产生诸多效应：

•  1)   T 细胞克隆的扩增

•  2)   细胞表面活化标志的上调

•  3)   分化成效应性细胞

•  4)   诱导细胞毒或细胞因子的分泌

•  5)   诱导凋亡

最常用的体外刺激检测T细胞增殖的方法是用TCR的抗原或竞争性抗体活化T细胞。本方案是一个基本方法，用CD3体外刺激小鼠脾T细胞和人类外周血 T 细胞的增殖，关键参数包括细胞密度、抗体滴度和活化动力学。

一、小 鼠 T 细 胞 活 化

用包被的anti-CD3e(145-2C11) 单抗刺激小鼠T细胞；MTT法测细胞增殖。

实 验 材 料

•   1X无菌PBS

•   Anti-Mouse CD3ε, Functional Grade (Clone:145-2C11) (MultiSciences, Cat#AM003E)

•   Anti-Mouse CD28, Functional Grade (Clone:37.51)（MultiSciences, Cat#AM028）

•   RPMI-1640完全培养基

•   无菌的小鼠脾脏或淋巴结单细胞悬液

•   96孔平底带盖微孔板 (Corning, Cat#3596)

•   刀豆蛋白A（ConA），可选 (Sigma, Cat#C5275)

•   MTT溶液（MultiSciences, Cat#MTT001, MTT细胞增殖检测试剂盒组分）

•   Formazan Solvent（MultiSciences, Cat#MTT001, MTT细胞增殖检测试剂盒组分）

•   红细胞裂解液（MultiSciences, Cat# LYS）

实 验 时 间

•    2 小时包被抗体

•   20 分钟制备脾脏单细胞悬液

•   20 分钟分析设置

•   2-4 天孵育

实 验 步 骤

1. 抗体包被至微孔板：

• 1)  用无菌PBS制备5-10µg/ml的anti-CD3e(145-2C11)抗体溶液，计算所需的抗体量，每个条件或样本需做复孔。例如，包被半块板（48孔板）需要2.6ml抗体溶液。若用其他抗体共刺激时，CD3抗体的浓度可以降低。

• 2)  96孔板中，每孔加入50μl抗体，空白对照孔加50μl无菌PBS。

• 3)  用ParafilmTM 膜将板封好，37℃孵育2小时或4℃过夜。

• 4)  加细胞之前，将孔内的抗体溶液吸去。

• 5)  每孔用200μl无菌PBS洗后，弃去PBS。

• 6)  重复洗一次，去除所有的未结合抗体。

2. 加细胞：

• 1)  取脾脏，无菌制备单细胞悬液，溶血去除红细胞。

• 2)  计数细胞并重悬RPMI-1640完全培养基中，浓度为106/ml。根据实验需要可选择2-3x106/ml～105/ml的浓度。

• 3)  洗板结束后，每孔加200μl细胞悬液，置于潮湿的37°C, 5% CO2培养箱中。可选择加刺激对照：ConA 1-4µg/ml刺激后孵育。

• 4)  加入2-5ug/ml anti-CD28抗体溶液。

• 5)  孵育 2-4 天。可根据具体的实验进行优化。

• 6)  每孔加 20μl MTT溶液，再放回至培养箱中孵育 4 小时。

• 7)  每孔加 50μl Formazan Solvent，轻轻振荡并孵育过夜。

• 8)  第二天分光度计测定OD570和参考波长OD690。

• 9)  计算平均值和标准方差，作图。

相 关 产 品

 

供应商	产品名称	货号	规格
MultiSciences	Anti-Mouse CD3e Monoclonal Antibody, Functional Grade	AM003E	20/50/100μg
MultiSciences	Anti-Mouse CD28 Monoclonal Antibody, Functional Grade	AM028	20/50/100μg
MultiSciences	红细胞裂解液（不含固定剂）(10×)	LYS	100/250/500T
MultiSciences	MTT细胞增殖检测试剂盒	MTT001	100T
Corning	96孔板，平底，带盖，TC表面，带盖，灭菌	3596	50包/箱

二、 人 T 细 胞 活 化

用包被的CD3 单抗刺激人外周血单个核细胞（PBMCs）；MTT法检测细胞增殖。

实 验 材 料

•  1X无菌PBS

•  Anti-Human CD3, Functional Grade (Clone:OKT3)（Multiscience, Cat: AH003）

•  Anti-Human CD28, Functional Grade (Clone:CD28.2)（Multiscience, Cat: AH028）

•  RPMI-1640完全培养基

•  无菌的人PBMCs

•  96孔平底带盖微孔板 (Corning, Cat#3596)

•  MTT溶液（MultiSciences, Cat#MTT001, MTT细胞增殖检测试剂盒组分）

•  Formazan Solvent（MultiSciences, Cat#MTT001, MTT细胞增殖检测试剂盒组分）

实 验 时 间

•  2-18 小时包被抗体

•  30 分钟制备人PBMCs

•  20 分钟分析设置

•  2-4 天孵育

实 验 步 骤

1. 抗体包被至微孔板：

•  1)  用无菌PBS制备5-10µg/ml的anti-CD3(OKT3)抗体溶液，计算所需的抗体量，每个条件或样品需做复孔。例如，包被半块板（48孔板）需要 2.6ml 抗体溶液。若用其他抗体共刺激时，CD3抗体的浓度可以降低。

•  2)  96孔板中，每孔加入50μl抗体，空白对照孔加50μl无菌PBS。

•  3)  用ParafilmTM 膜将板封好，37℃孵育2小时或 4℃过夜。

•  4)  加细胞之前，将孔内的抗体溶液吸去。

•  5)  每孔用200μl无菌PBS洗后，弃去PBS。

•  6)  重复洗一次，去除所有的未结合抗体。

2. 加细胞：

•  1)  制备 PBMCs 并重悬于RPMI 完全培养基中，浓度为106/ml。根据实验需要可选择2-3x106/ml～105/ml的浓度。

•  2)  洗板结束后，每孔加 100μl 细胞悬液，每个样本重复做3个孔。

•  3)  加入2-5ug/ml anti-CD28抗体溶液。

•  4)  37°C, CO2培养箱孵育 2-4 天。可根据具体的实验进行优化。

•  5)  每孔加 20μl MTT溶液，再放回至培养箱中孵育 4 小时。

•  6)  每孔加 50μl Formazan Solvent，轻轻振荡并孵育过夜。

•  7)  第二天分光度计测定OD570和参考波长OD690。

•  8)  计算平均值和标准方差，作图。

相 关 产 品

 

供应商	产品名称	货号	规格
MultiSciences	Anti-Human CD3 Monoclonal Antibody, Functional Grade	AH003	20/50/100μg
MultiSciences	Anti-Human CD28 Monoclonal Antibody, Functional Grade	AH028	20/50/100μg
MultiSciences	人淋巴细胞分离液	LSM01	200ml
MultiSciences	MTT细胞增殖检测试剂盒	MTT001	100T
Corning	96孔板，平底，带盖，TC表面，带盖，灭菌	3596	50包/箱