【操作步骤】

1、取 100ul 全血，按照细胞表面抗原染色方法标记 CD4 和 CD25。根据说明书和抗体管上的标识确定抗体用量（联科流式抗体用量一般是5ul）。按个人要求设置空白管、对照管、补偿管和样本管。室温避光孵育15分钟。
2、用蒸馏水（不能用 PBS）将红细胞裂解液（10×）稀释成1×工作液。每管用量为 2ml。
3、染色完的全血不用洗，加2ml稀释好的红细胞裂解液，迅速混匀，室温避光孵育15分钟，观察溶液透亮后用预冷 PBS 溶液洗涤细胞，300 -400g离心5分钟，去上清。
4、将Fixation/Permeabilization Concentrate和Fixation/Permeabilization Diluent按1:3比例制备成1×工作液（Cat# IC001组分，联科生物）。在流式管中染色，每个样本需要1ml。保存勿超过1天。
5、旋涡震荡重悬细胞后加入1ml 1×Fixation/Permeabilization 工作液，并再次旋涡混匀。室温避光孵育 30 - 60 分钟。
6、用蒸馏水将10×Permeabilization Buffer 稀释为1×工作液。在流式管中染色，每个样本需要8.5ml。剩余溶液在 2 - 8℃最多保存 1 周。
7、无需洗涤，每管加入 2 ml 1× Permeabilization Buffer（Cat# IC001组分，联科生物）。室温下 300 - 400 × g 离心 5 分钟，弃去上清。
8、（可选）重复上一步操作洗涤细胞。
9、加入100 ul 1× Permeabilization Buffer PBS 重悬细胞。
10、（封闭可选）加入大鼠血清 2 ul，室温避光孵育 15 分钟。
11、加入适量的 Foxp3 抗体，对照管中加入适量的同型对照，具体用量参照说明书（联科流式抗体用量一般是5ul），室温避光孵育至少 30 分钟。
12、加入 2ml 1×Permeabilization Buffer，室温下300 - 400 ×g离心5分钟，弃去上清。
13、重复上一步操作洗涤细胞。
14、用适量体积的 Flow Cytometry Staining Buffer 重悬细胞，并上机检测并分析。注：由于染色过程中使用了细胞固定和破膜，对比起活细胞在形态上会有一定变化，因此FSC/SSC 图中圈门时需要做一定调整。
以上说明书仅供参考，具体实验请对照厂商说明书操作。

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