1. 在每个流式上样管中加入 100 µl 准备好的细胞悬液，细胞数约为 1x10^6 个。

2. 按照细胞表面抗原染色方法标记表面抗原。按照说明书加入适量的 CD4 和 CD25 抗体。4 ℃孵育30 分钟。

3. 用预冷 PBS 洗涤细胞，离心去上清。

4. 用 3 倍体积的固定/破膜稀释液（#ICD01） 稀释 固定/破膜浓缩液（#ICC01），制成固定/破膜工作液，注意要新鲜配制，每管的用量为 1ml。

5. 旋涡震荡重悬细胞后加入 1ml 的固定/破膜工作液（1:3 稀释好），并再次旋涡混匀。

6. 避光 4℃孵育 30 分钟。

7. 将破膜缓冲液（#ICB01）用去离子水 1:9 稀释，制成破膜缓冲液工作液。每管的用量为 8.5ml。

8. 加入 2ml 破膜缓冲液工作液（1:9 去离子水稀释），离心洗涤细胞并弃去上清液。

9. （可选）用 100ul 破膜缓冲液工作液重悬细胞，加入 2µl Anti-Mouse CD16/CD32 (2.4G2), Purified（#AM016）进行阻断，室温避光孵育 15 分钟。

10. 无需洗涤，加入 Foxp3 抗体或 PE Rat lgG2a 同型对照（用破膜缓冲液工作液进行稀释），避光 4℃孵育至少 30 分钟。建议进行预实验摸索出抗体的最适浓度。

11. 加入 2ml 破膜工作液离心洗涤细胞并弃去上清液。

12. 用适量体积的 Flow Cytometry Staining Buffer 重悬细胞，并上机检测并分析。

注：由于染色过程中使用了细胞固定和破膜，对比起活细胞在形态上会有一定变化，因此 FSC/SSC 图中圈门时需要做一定调整。

以上步骤仅供参考，以厂家说明书为准。