近日，CRISPR魔剪升级版黑科技，单碱基编辑技术（Base Editing）连续入选顶尖期刊《自然》杂志十大人物以及《科学》杂志十大突破，应用单碱基编辑技术治疗“贝多芬小鼠”也荣登权威期刊《Nature》。

 

著名华人科学家哈佛大学David Liu教授引领单碱基编辑技术

近日，CRISPR魔剪升级版黑科技，单碱基编辑技术（Base Editing）连续入选顶尖期刊《自然》杂志十大人物以及《科学》杂志十大突破，应用单碱基编辑技术治疗“贝多芬小鼠”也荣登权威期刊《Nature》。

众所周知，在基因编辑领域，MIT的张锋教授、美国加州大学伯克利分校教授Jennifer Doudna、德国马普感染生物学研究所教授Emmanuelle Charpentier、哈佛大学遗传技术狂人George Church等一众大咖引领着这个领域的发展。然而，自打单碱基编辑技术出现之后，哈佛大学的David Liu教授团队逐渐引领这一细分领域，成了名副其实的基因编辑技术大牛，未来很有可能持续走热。

贝多芬小鼠

 

耳聋作为最常见的感觉性损伤，大约50％是由遗传因素导致的，而TMC1便是引起遗传性耳聋的常见基因之一，TMC1突变可引起常染色体隐性和常染色体显性非综合征型耳聋。

近日，十大人物的同一期《自然》期刊，David Liu教授研究团队再次发布了一项CRISPR重磅研究，利用单碱基编辑技术成功修复了名为“贝多芬小鼠”小鼠的TMC1基因突变，从而减少了小鼠的听力损失，为遗传性耳聋的基因治疗奠定了基础。

魔剪升级版-单碱基编辑

单碱基编辑技术是基于CRISPR-Cas基因编辑系统开发出来的一种有用的单个碱基替换手段。其主要是通过将失去酶活性的dCas9蛋白与脱氨基酶比如APOBEC1或者AID融合而成，因此，既具有了dCas9结合特定DNA序列的定位能力，又具有改变碱基的能力。

这里就不得不提到一类能够将胞嘧啶（C）变成胸腺嘧啶（T）的酶（实际上是先将C变成U，然后通过细胞中DNA的修复或复制机制将U变成T），叫做胞嘧啶核苷脱氨酶（cytidine deaminase），比如APOBEC1 (apolipoprotein B editing complex 1) 或者AID (activation-induced deaminase)等等。将这些酶与基因编辑工具比如ZFN、TALEN或者dCas9等等蛋白质融合，就可以在特定的位点将C转变成T，从而达到修复突变的目的（原理如下图）。

 

▲单碱基编辑技术的原理图（图片来源于Nature）

利用单碱基编辑技术修复基因突变这个过程是怎样的呢？

如上面的图所示，这里举的是dCas9与胞嘧啶核苷脱氨酶融合催化特定序列的C变成T的过程。首先是dCas9-cytidine deaminase复合物在引导RNA的引导下与特定位点的基因组DNA结合，目的是要把这个位点的C（或G）突变变成T（或A）；复合物结合到靶序列之后，接着cytidine deaminase催化C脱氨基变成U（尿嘧啶），由于尿嘧啶U不是DNA中的碱基类型，并且另一条DNA链中的G和U也不配对，因此接下来就会在DNA复制或者DNA修复的过程中，U（或者G）就被替换成T（或者A），从而达到了将C（或者G）变成T（或者A）的目的。

▶顶尖期刊发了一大把◀

众所周知，在基因编辑领域，MIT的张锋教授、美国加州大学伯克利分校教授Jennifer Doudna与德国马普感染生物学研究所教授Emmanuelle Charpentier、哈佛大学遗传技术狂人George Church等一众大咖引领着这个领域的发展，发表国际顶尖期刊《自然》、《科学》及《细胞》等大文章发到手软。

而自打哈佛大学的David Liu团队进入单碱基编辑这一领域之后，便在这一领域一骑绝尘！事实上，单碱基编辑技术很大程度上是由David Liu团队改造并持续引领这一领域的发展。其发明的单碱基编辑技术采用dCas9融合大鼠的rAPOBEC1，目前都已经开发到第四代，简称BE4

目前都已经开发出哪些应用于单碱基编辑的工具了呢？

主要有下面这几种：1）dCas9融合大鼠的rAPOBEC1，目前都已经开发到第四代，简称BE4；2）dCas9融合七鳃鳗或者人的AID （activation-induced cytidine deaminase, AID），简称Target-AID；3）CRISPR-x，由dCas9以及sgRNA组成，只不过这个sgRNA包含有MS2 RNA短发加结构，这样一来，这种sgRNA就可以招募MS2蛋白融合的AID进行base editing；4）ZFN或者TALEN融合的AID或者APOBEC。这些相应的base editing工具总结如下面的Table1所示（不完全统计）。

 

▲Table1：部分单碱基编辑工具总结（图片来源于Nature）

 

▶应用领域◀

那么，这些单碱基编辑方法目前有哪些应用呢？或者未来可能能够应用到哪些方面呢？

主要可能有这几个方面：首先，可以应用于基因突变疾病的修复治疗研究；其次，应用于动物模型的研究及细胞研究；第三，可以应用于农业领域；第四，可以结合sgRNA库应用于基因或者药物的大规模筛选（如下面的图A-C所示）。

▲单碱基编辑工具的应用举例总结（图片来源于Nature）

精确高效的单碱基编辑成功，是一个重大的进步。与传统的CRISPR-Cas基因编辑相比，单碱基编辑技术不需要核酸链的完全断裂，于是大大避免了因修复核酸链断端而引入的错误，可以在很多情况下大大降低脱靶率。

可以预见，未来单碱基编辑一定可以作为基因编辑系统的一个重要工具，在基因治疗，育种等领域发挥重要作用。而对于发文章的科研工作者而言，可以持续关注这一领域动态，为自己的研究加码。

参考资料：

1.Kim D et al. Genome-wide target specificities of CRISPR RNA-guided programmabledeaminases. Nat Biotechnol. 2017 May;35(5):475-480. doi: 10.1038/nbt.3852. Epub2017 Apr 10.

2.Hess GT et al. Methods and Applications of CRISPR-Mediated Base Editing inEukaryotic Genomes. Mol Cell. 2017 Oct 5;68(1):26-43. doi:10.1016/j.molcel.2017.09.029.